Noch immer wird die Menschheit von den Attacken der Engel heimgesucht. Zum Glück kann die NERV Organisation mit Verstärkung rechnen: Neben EVA 01-Kampfpilot Shinji nehmen auch die beiden Pilotinnen Asuka und Mari den Kampf gegen die immer häufiger auftretenden Angriffe der Engel auf. Doch diese scheinen nicht die einzigen Widersacher zu sein, mit denen sich NERV auseinandersetzen muss. Denn eine mysteriöse Geheimorganisation namens SEELE scheint an einem Projekt zu arbeiten, das den sogenannten „Third Impact“ herbeiführen könnte - Sollte dieser Plan gelingen, dann würde das Leben auf der Erde eine weitere, diesmal endgültige Veränderung erfahren ...